例如，人類造血幹細胞可用於需要骨髓移植之醫學治療中。 此類程序係用於治療許多疾病，例如晚期癌症（諸如卵巢癌及白血病）以及損害免疫系統之疾病。 造血幹細胞可例如藉由下列方式獲得：將癌症或AIDS患者之成體體細胞（例如，上皮細胞或淋巴球）與除核卵母細胞（例如，牛卵母細胞）融合，如上所述獲得胚胎或類幹細胞，及在有利於分化之條件下培養此類細胞，直到獲得造血幹細胞。
在一個實施例中，活化培養物進一步包含介白素-2 (IL-2)。 在此背景下，仍需要用於將體細胞重編程為多能狀態之改良材料及方法。 庫一般係化合物之集合，該等化合物可經呈現或展示而使得可在篩選檢定中識別該等化合物。
重編程亦涵蓋將體細胞之分化狀態部分反轉為使細胞更容易在經受額外操作（諸如本文中所述者）時完全重編程為多能狀態之狀態。 此類接觸可導致細胞表現特定基因，而此表現會促成重編程。 在本發明之某些實施例中，體細胞之重編程會造成體細胞處於多能及類ES狀態。 所得之細胞在本文中係稱為經重編程之多能體細胞或誘導性多能幹細胞。 在一些實施例中，重編程亦涵蓋將體細胞之分化狀態部分反轉為多潛能狀態。 在又另一態樣中，本文提供一種經單離誘導性多能幹細胞群，其包含多能細胞，其中該等多能細胞包含用於表現一或多種重編程因子的構件，且/或其中該等多能細胞包含用於編碼TRG及TRD基因之重排的構件。
當維持在選擇性條件下足夠期間時，表現標記之細胞因而可大部分地或完全地自細胞群中消除。 如本文中所使用，用語「誘導性多能幹細胞」或「iPSC」係指生產自經分化成體細胞之幹細胞，該經分化成體細胞已經誘導或改變（即，重編程）為能夠分化成所有三種胚層或皮層（中胚層、內胚層、及外胚層）之組織的細胞。 如本文中所使用，「細胞系」係指大部分或實質上相同細胞之族群，其一般係衍生自單一祖先細胞或自已定義及/或實質上相同之祖先細胞群。 細胞系可能已能夠或可能能夠被長期間（例如，數月、數年、無限期間）維持於培養物中。 其可能已經歷自發性或誘導性轉化程序，從而賦予細胞無限的培養壽命。
在最後一次洗滌時，將細胞用40 mL的DPBS洗滌一次。 相比之下，生長在層黏蛋白-511塗佈盤（無滋養細胞之培養）上或與有絲分裂去活化T細胞耗竭之自體PBMC（基於滋養細胞之培養）共培養之經SeV轉導PBMC的實驗組（富集3天、8天、或13天）皆不會產出任何群落。 生長在MEF滋養層上的來自第8天PBMC培養物之經富集γδ T細胞亦不會產出任何群落。 經由細胞-細胞團塊富集來間接富集經活化γδ 副甲狀腺荷爾蒙2025 T細胞。
第一及第二內源多能性基因兩者之表現指示cDNA會編碼活化至少兩種內源多能性基因在體細胞中表現之基因。 因此，在一個態樣中，本文提供用於治療或預防哺乳動物之疾病或病症的方法。 副甲狀腺荷爾蒙2025 在一個實施例中，該等方法係以自個體獲得體細胞開始，重編程藉由本發明之方法獲得的體細胞以獲得iPSC。 接著將iPSC在適用於將iPSC發育為所欲細胞類型之細胞的條件下培養。 採集所欲細胞類型之經發育細胞並將其引入個體中以治療疾病或病症。 副甲狀腺荷爾蒙 在一替代性實施例中，該等方法係以自個體獲得體細胞開始，重編程根據本發明方法之體細胞。
使用細鑷子將含有經固定及染色細胞之蓋玻片自24孔盤中取回。 在IHC染色當天，將培養基自含有經iPSC群落接種之蓋玻片的24孔盤中吸出，將蓋玻片用0.5 mL的DPBS洗滌兩次。 針對ABI螢光偵測，經常會觀察到前峰，其為由於ABI平台所使用之偵測方法所致的假影。 前峰有時會偏斜且在右側具有朝向真正的峰傾斜的底部。
在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養1至3天。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養12至72小時。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養12至60小時。
代表性峰顯示來自群落A、B、C、D、及E之基因組PCR的擴增子大小（以鹼基對計）。 〔 圖4 〕顯示iPSC群落中之TRG及TRD基因座基因重排的評估。 代表性瓊脂糖凝膠影像顯示由Vγ9或Vδ2正向引子結合各種連接區引子所介導之來自群落A、B、及C的基因組DNA之擴增。 作為陰性對照組，使用22 Rv1細胞系基因組DNA。 〔 圖5 〕顯示代表性序列比對，其顯示獲自擴增子（來自群落B）之序列與人類TCR Vγ9及Vδ2序列之間的相似性。
圖 7B顯示重疊免疫組織化學影像，其視覺化iPSC群落中對DAPI（僅藍色）、標記（Nanog/Oct 3/4/Sox2：僅紅色）、或DAPI +標記（粉紅色）呈陽性的細胞。 圖 7C顯示代表性直方圖，其顯示在iPSC群落A、B、C、D、及E中對SSEA-4及TRA 1-60表面表現及Oct-3及Sox2胞內表現呈陽性的細胞之頻率。 〔 副甲狀腺荷爾蒙2025 圖8A 〕 至 〔 圖8D 〕顯示iPSC群落B、C、D、及E經由核型分析之基因組穩定性評估。 圖 8A：群落B； 圖 8B：群落D； 圖 8C：群落C； 圖 8D：群落E。 〔 圖9 〕顯示代表性明視野顯微鏡影像，其顯示來自所有五個群落（群落A至E）的基於滋養之iPSC群落，該等群落係過繼至不同基質及培養基組合存在下之無滋養細胞條件。 相比之下，與反轉錄病毒系統相關聯之困難應藉由使用本揭露之iPSC（其係類ES細胞）而消除。
用語「多能性因子」係用於指多能性相關基因之表現產物，例如由該基因編碼之多肽。 在一些實施例中，多能性因子係正常實質上不表現於體細胞類型中者，該等體細胞類型構成成體動物之身體（除了生殖細胞或其前體外）。 例如，多能性因子可係在ES細胞中之平均水平至少50倍或100倍大於在存在於成體哺乳動物身體中的終末分化細胞類型中之平均水平者。 在一些實施例中，多能性因子係維持體內ES細胞及/或使用習知方法衍生之ES細胞的活力或多能狀態所不可或缺者。
四環素類似物包括展示與四環素之結構同源性且能夠活化四環素誘導性啟動子之任何化合物。 例示性四環素類似物包括例如多西環素、氯四環素、及無水四環素。 在一些實施例中，經單離細胞群係衍生自容易取得且僅需要最低侵入程度之細胞類型，諸如纖維母細胞、皮膚細胞、臍帶血細胞、周邊血液細胞、及腎上皮細胞。 本揭露之經單離細胞群包括非為幹細胞、生殖細胞、或iPSC之任何身體T細胞。
如實施例A1至A34中任一者之方法，其中所生產之該等iPSC在過繼後可生長於無滋養細胞之培養基中。 一種誘導性多能幹細胞，其係根據實施例A1至A35中任一者之方法生產。 一種醫藥組成物，其包含如實施例A36之iPSC及醫藥上可接受之賦形劑。 一種經分化細胞，其係根據實施例A26之方法生產。
針對所有三個群落，偵測到TRG基因之重排為代表Vγ9-JP之單帶。 針對群落A，偵測到TCRδ基因重排為Vδ2-Jδ1。 針對群落B及C，偵測到Vδ2-Jδ3重組，其指示這些群落帶有Vγ9及Vδ2基因重排（ 圖 4）。 在所有三個群落中觀察到GAPDH擴增而作為管家控制基因。 在使獲自基因組PCR之擴增子經受毛細管電泳（如第7.3.2節中所詳述）後，在所有群落中觀察到大約191及192 bp之所欲大小的擴增子，此證實TRG基因座處之特定Vγ9基因重排（ 圖 3）。
這在樣品對照組大小標準液預混液中特別明顯，其中96-bp峰在84 bp處具有前峰。 使用GenElute™哺乳動物基因組DNA小量製備套組(cat # G1N70-1Kt, Sigma)，將來自iPSC群落及22Rv1細胞之基因組DNA單離出來，如以下規程中所詳細描述。 受損的群落可能要更久（7至10天）才會回復。 培養基需要每24小時更換為新鮮培養基，直到iPSC完全回復。
將一小瓶的冷凍iPSC（來自基於滋養細胞或無滋養細胞之培養）在37℃水浴中快速解凍。 將小瓶內容物逐滴添加至50 mL錐形管中，試管含有25 mL的StemFit Basic 2.0培養基（針對基於滋養細胞之培養）或含有10 µM ROCK抑制劑之mTeSR培養基（針對無滋養細胞之培養）。 重要的是要確保細胞係逐滴添加，因為將細胞突然添加至培養基中將會造成滲透性休克。 在培養期結束時，藉由以一個連續動作倒轉含有試管之磁鐵來收集含有經富集細胞懸浮液之培養基。 在多個試管的情境下，在試管置於磁鐵座上時自試管收集上清液（藉由1 mL吸量管手動進行），且不擾動已結合之磁性粒子。 為了產生γδ T細胞衍生iPSC，將來自健康個體之全PBMC與唑來膦酸單水合物、介白素-2、及介白素-15 (Zol + IL-2 + IL-15)培養不同的期間（3天、8天、及13天）。
- 在某些實施例中，細胞係維持於培養物中12至60小時。
- 這些細胞之分化將導致亦表現TK基因之所關注治療性細胞的單離。
- 使用iPSC之經分化細胞組織及器官可用於藥物研究中。
- 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群中之γδ T細胞包含5%至100% TCRVγ9+ T細胞。
- 合適的醫藥上可接受之載劑包括但不限於抗氧化劑（例如，抗壞血酸）、保存劑（例如，苯甲醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸酯）、乳化劑、懸浮劑、分散劑、溶劑、緩衝劑、潤滑劑、填料、及/或稀釋劑。
- 負向選擇及可用於負向選擇之標記在本文中所述之某些方法中亦受到關注。
如實施例B1至B12中任一者之方法，其中在步驟中該等γδ T細胞之至少一部分經活化為Vγ9+ γδ T細胞。 如實施例B1至B12中任一者之方法，其中在步驟中該等γδ T細胞之至少一部分經活化為Vγ9δ2+ γδ T細胞。 副甲狀腺荷爾蒙2025 如實施例B1至B14中任一者之方法，其中該一或多種重編程因子係選自由下列所組成之群組：OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28、及c-Myc。 如實施例B1至B15中任一者之方法，其中在步驟中經轉導之該等γδ 副甲狀腺荷爾蒙 T細胞係於一或多個滋養層存在下培養。 副甲狀腺荷爾蒙2025 如實施例B16之方法，其中在步驟中經轉導之該等γδ T細胞係於單層的滋養層存在下培養。
此套組由單一預混液所組成，其含有靶向Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ10、及Vγ11及Jγ1/Jγ2、JγP、及JγP1/JγP2區之引子（接合至6-FAM螢光染料）。 接著藉由毛細管電泳分離，並藉由GeneMapper軟體分析。 PCR擴增子具有預期之大小範圍，其介於159與207個鹼基對之間。
將24孔盤在含有5% CO 2之37℃加濕培養箱中培養。 副甲狀腺荷爾蒙 在24小時培養後，將含有ROCK抑制劑之培養基更換為不含ROCK抑制劑之新鮮mTeSR培養基。 即使在整個培養期間持續使用ROCK抑制劑，仍未觀察到實質差異。
如本文中所使用，用語「多能」係指細胞形成所有身體或細胞體（即，胚體）譜系的能力。 例如，胚胎幹細胞係多能幹細胞的一種類型，其能夠自三種胚層（外胚層、中胚層、及內胚層）之各者形成細胞。 多能性是一連串的發育潛能，範圍從無法產生完整器官的非完全或部分多能細胞（例如，上胚層幹細胞或EpiSC）到能夠產生完整器官的更原始、更多能細胞（例如，胚胎幹細胞）。 在某些實施例中，該方法進一步包含向對象投予經分化之細胞。 在某些實施例中，該方法進一步包含單離及/或純化所生產之iPSC。
在另一具體實施例中，本文提供一種經單離誘導性多能幹細胞群，其包含表現一或多種重編程因子之多能細胞，其中該等多能細胞包含編碼TRG及TRD基因之重排的核苷酸序列，且其中該等重編程因子係Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、及Lin28。 本文亦提供具有新穎特性之經單離誘導性多能幹細胞群。 在一些實施例中，經單離iPSC群包含表現一或多種重編程因子之多能細胞，且包含編碼TRG及TRD基因之重排的核苷酸序列。
- 自PBMC之Zol刺激後的第3天起，可觀察到含有經活化細胞之細胞-細胞團塊或母細胞。
- 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群中之γδ T細胞包含5%至85% TCRVγ9+ T細胞。
- 在另一具體實施例中，本文提供一種經單離誘導性多能幹細胞群，其包含表現一或多種重編程因子之多能細胞，其中該等多能細胞包含編碼TRG及TRD基因之重排的核苷酸序列，且該經單離iPSC群不會生產來自TCRA及TCRB基因座之PCR產物。
- 如實施例D1至D5中任一者之方法，其中該經單離細胞群係終末分化細胞。
- 全PBMC中之Vγ9 +γδ T細胞係由Zol選擇性地活化。
經幅照MEF係自ATCC以冷凍小瓶(cat # SCRC-1040.1, ATCC)獲得且依ATCC所述解凍。 計數解凍細胞，然後在將iPSC群落轉移至細胞上的前一天，將細胞以50萬個細胞/孔在6孔盤中之密度接種在經明膠塗佈盤上於MEF培養基（其密度可根據不同條件而變化）中。 不同於經絲裂黴素C處理之MEF單層，經幅照MEF單層僅持續5至7天。
然而，此類藥物具有明顯的不良副作用（例如，免疫抑制、致癌性質），且非常昂貴。 本發明應會消除（或至少大幅減少）對於抗排斥藥物（諸如環孢素、移護寧、FK-506、糖皮質素、及雷帕黴素、及其衍生物）之需要。 醫藥組成物一般包含治療有效量的至少一種所生產之iPSC或自其分化之細胞、及醫藥上可接受之載劑。 合適的醫藥上可接受之載劑包括但不限於抗氧化劑（例如，抗壞血酸）、保存劑（例如，苯甲醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸酯）、乳化劑、懸浮劑、分散劑、溶劑、緩衝劑、潤滑劑、填料、及/或稀釋劑。 可使用之典型緩衝劑包括但不限於醫藥上可接受之弱酸、弱鹼、或其混合物。
將37 µL的經漩渦震盪磁性粒子添加至經富集細胞懸浮液，接著將其混合並在室溫下培養5分鐘。 將含有細胞懸浮液之試管放在磁鐵座上並在室溫下培養5分鐘。 藉由以一個連續動作倒轉含有試管之磁鐵，將細胞懸浮液轉移至新的15 mL試管中來收集經富集細胞。 接著將試管用10 mL的完全RPMI培養基(RPMI + 10% FBS+1x Pen/Strep)加滿。 採集第3天或第8天Zol培養之PBMC，並在室溫下將其以1500 rpm離心沉降5 min。
在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至100% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至95% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至90% 副甲狀腺荷爾蒙 γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至85% γδ T細胞。
