從在第3-7天中所取的樣品來看，12/15名患者是陽性的，最高的滴度是3，36xl05vp/ml血清。 總之，數據顯示了 Ad5-DM-GM_CSF在免疫活性的攜帶腫瘤的動物中具有抗腫瘤活性，並且其能夠引起腫瘤特異性的免疫性，以至排斥相同腫瘤的隨後攻擊的程度。 對於熒光素酶檢測，爲了測試衣殼修飾對轉導效力的影響，將細胞接種到兩個M 孔板中，50000細胞/孔。 24h後，用Ad51ucl或Ad5/31ucl以2% DMEM中500vp/細胞和 5000/vp/細胞的濃度一式三份感染細胞。 如同在實施例3III中類似地分析熒光素酶的表達（確定中和抗體滴度）。
圖7c顯示了通過在歸檔的腫瘤樣品中對Ad5-D25_GMCSF的受體CAR(柯薩奇-腺病毒受體）進行染色，而對Ad5-D25-GMCSF轉導腫瘤的預測。 圖fe-d顯示了 GMCSF的表達不損害病毒複製和細胞殺傷效果。 與現有技術的腺病毒工具相比，本發明提供了用於癌症治療的更簡單、更有效、不昂貴、無毒的和/或更安全的工具。 除了使得載體能夠轉運到目的位點，本發明的載體也確保了轉基因的表達和持續。
副甲狀腺癌: 分子標的薬治療
載體的有效劑量至少取決於需要治療的受試者、腫瘤類型、腫瘤的位置和腫瘤的階段。 劑量可變化，例如從約IOeS病毒顆粒（VP)至約10el4VP，優選地從約hl0e9VP至約 10el3VP並且更優選地從約8xl0e9VP至約10el2VP。在本發明的一個特定實施方式中，劑量在約5xl0el0-5xl0ellVP的範圍內。 此外，已知Ad5通過纖毛的節部分結合被稱爲CAR的受體，並且對所述節部分或纖毛的修飾可改善向靶細胞的進入並在一些癌症中引起增加的溶瘤作用（Ranki T.等人 2007，Int J Cancer 121， )。的確，衣殼經修飾的腺病毒對於改善的向癌細胞的基因遞送而言是有利的工具。 圖13a_i顯示了克隆的圖示，以產生帶有GM-CSF的穿梭質粒（pTHSN)、產生含有所有腺病毒基因並帶有El區中的M個鹼基對缺失（其介導癌細胞中的選擇性複製）的質粒和產生除了被GM-CSF替代的gpWk和6. 7K外而含有所有腺病毒基因的Ad5/3-DM_GMCSF 質粒（pAdOT24. GM-CSF)。
這種能在體內外與腫瘤細胞特異性識別結合的多肽被簡稱爲腫瘤靶向肽。 35.增加受試者中腫瘤特異性免疫應答的方法，其中所述方法包括：a)將包含根據權利要求1-15中任一項的的溶瘤性腺病毒載體的媒介運送至靶細胞或組織，b)在所述細胞中表達所述載體的GM-CSFJPc)在所述靶細胞或組織中增加細胞毒性T細胞和/或天然殺傷細胞的量。 在所述Ad5-DM-GM_CSF治療之前或之後接受了不間斷的施用環磷酰胺的患者中利用了此方法，並在從這些患者中收穫的PBMC上進行了 T reg分析。
副甲狀腺癌: 患者さん向け
採用人工固相合成帶有Bam HI和Xho I酶切位點的DNA引物，以已構建的質粒EGFP-ELBD-H2-pET28a中的ELBD-H2基因爲模板進行PCR擴增，並添加酶切位點Bam HI和Xho I。 轉化E.coli DH5α菌株，37℃過夜培養15h，質粒DNA回收試劑盒純化重組質粒DNA，送DNA序列測序公司測序驗證。 上述劑型中可用於注射途徑給藥的劑型包括：注射劑、注射用無菌粉末，它們是將藥物與一種或多種藥學上可接受的賦形劑混合製成以供注射給藥的形式。 此外，還需加入抑菌劑(如苯甲醇、羥苯丁酯、硫柳汞)、 等滲調節劑(如氯化鈉、葡萄糖)、助懸劑(如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素)、增溶劑(吐溫-80、卵磷酯)、抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉)和填充劑(如乳糖、甘露醇)。 通常，有效量足以緩和、改善、穩定、減慢或延遲疾病的進一步發展。
- 在本發明中，將GM-CSF轉基因置於缺失了 gpl9k/6.
- 如在本申請中所使用的，“衣殼”指病毒的蛋白質外殼，其包括六鄰體、纖毛和五鄰體基質蛋白。
- 可使用任何常規的方法來將所述載體或組合物施用給受試者。
- 例如，可通過例如啓動子將病毒複製限制在靶細胞中，所述啓動子包括但不限於CEA，SLP，Cox-2，肝素結合細胞因子，hTERT，hTERT的變體，E2F，E2F的變體，CXCR4，SCCA2和TTS。
- 在治療之前和之後，用⑶3、⑶8和六鄰體特異性四聚抗體對收穫自以Ad5-DM-GMCSF治療的患者的白細胞進行染色，並通過流式細胞術進行分析。
- 在本發明中可使用改善病毒向腫瘤細胞的遞送的任何衣殼修飾（即本領域已知的對六鄰體、纖毛和/或五鄰體基質蛋白的修飾）。
- 38.根據權利要求37的溶瘤性腺病毒載體的用途，其中靶細胞或組織中天然殺傷細胞和/或細胞毒性T細胞的量增加了。
整個受體蛋白由三部分組成：胞外區，由氨基端的621個氨基酸殘基構成，存在配體結合區；跨膜區，由23個氨基酸殘基組成的螺旋狀疏水區結構深埋在細胞膜脂質雙層中，將受體蛋白本身錨定在細胞膜上；胞內區，由542個氨基酸殘基構成，可進一步細分爲3個亞區：近膜亞區，酪氨酸激酶亞區，羧基端亞區。 24.根據權利要求19-23中任一項的用途或方法，其中在治療期間施用溶瘤性腺病毒載體或藥物組合物數次。 20.治療受試者中的癌症的方法，其中所述方法包括向受試者施用根據權利要求1-15 副甲狀腺癌2025 或17中任一項的載體或藥物組合物。 19.根據權利要求1-15中任一項的腺病毒載體在製備藥物中的用途，其中所述藥物用於治療受試者中的癌症。 在本發明的優選實施方式中，所述方法或用途還包括向受試者施用維拉帕米或另一種鈣通道阻斷劑。 “鈣通道阻斷劑”指一類藥物和天然物質，其破壞鈣通道的傳導，並且其可以選自：維拉帕米、二氫吡啶類、加洛帕米、地爾硫卓、咪拉地爾、苄普地爾、氟司必林和芬地林。
副甲狀腺癌: 副甲狀腺腫瘍の
爲了進一步提高腫瘤穿透性和抗腫瘤效果的局部放大，構建了選擇性的溶瘤劑， 副甲狀腺癌 例如條件性複製的腺病毒。 腫瘤細胞是由於溶瘤性腺病毒在腫瘤細胞中的複製而被所述病毒殺死的，複製的最後時期導致數千的病毒粒子被釋放到周圍的腫瘤組織中用於有效的腫瘤穿透和脈管再次感染。 腫瘤細胞允許病毒的複製而正常的細胞由於病毒基因組中經改造的變化而倖免，所述變化防止在非腫瘤細胞中複製。 表皮生長因子受體家族的成員包括ErbB1/HER1/EGFR，ErbB2/HER2，ErbB3/HER3和ErbB4/HER4四種，同屬於酪氨酸激酶類受體。 人EGFR蛋白由1186個氨基酸殘基的組成，相對分子量爲17萬道爾頓。
副甲狀腺癌: 副甲狀腺機能亢進症顎腫瘍症候羣（Hyperparathyroidism-jaw tumor syndrome：HPT-JT症候羣）
本發明通過以新的和有創造性的方式利用腺病毒的溶瘤和免疫治療特性，提供了具有前述特性的癌症治療工具。 血清型被分爲6個亞組A-F並且不同的血清型已知與不同的病況（即呼吸系統疾病、結膜炎和腸胃炎）相關。 副甲狀腺癌2025 已知腺病毒血清型5引起呼吸系統疾病並且其是基因療法領域中所研究的最常見的血清型。
副甲狀腺癌: 副甲狀腺癌の原因
此外，最優的載體必須在靶組織或細胞中保持是有活性的。 副甲狀腺癌 在過去的幾十年中已經開發了病毒載體的所有這些特性並且在生物醫學中廣泛地研究了例如逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒載體。 副甲狀腺癌 如權利要求12所述的綴合物，其特徵在於所述治療成分包含放射性治療成分，化學治療成分，抗體，酶，或它們的組合。 一種腫瘤靶向多肽，其包含氨基酸序列爲YXGXR所示的第一序列和氨基酸序列爲YXGXR所示的另一第二序列，所述第一序列與所述第二序列之間通過連接肽鏈接，其中Y表示酪氨酸或其衍生物；G表示甘氨酸或其衍生物；R表示精氨酸或其衍生物；X表示含側鏈帶脂肪類基團或/和羥基類基團或它們組合或其衍生物的氨基酸。 MAP30同樣也是一種具有抗腫瘤活性的蛋白藥物，其來自於苦瓜種子，也是一種RIP蛋白。 將其與ELBD-H2融合表達後，MAP30-ELBD-H2對腫瘤細胞HeLa、B16細胞的抑制率顯著提高，然而對正常細胞MRC-5的抑制率沒有顯著提高(圖8)。
副甲狀腺癌: 患者さんの手記
環磷酰胺是常見的化學治療劑，其也被用於一些自體免疫病症中。 在本發明中，環磷酰胺可被用於提高病毒的複製和GM-CSF所誘導的對NK和細胞毒性T細胞的刺激對於增加的抗腫瘤免疫應答的效果。 其可作爲靜脈內推注劑量或低劑量的口服不間斷施用而被使用。 在本發明的一個實施方式中，所述溶瘤性腺病毒載體包含衣殼修飾。 如在本申請中所使用的，“衣殼”指病毒的蛋白質外殼，其包括六鄰體、纖毛和五鄰體基質蛋白。 在本發明中可使用改善病毒向腫瘤細胞的遞送的任何衣殼修飾（即本領域已知的對六鄰體、纖毛和/或五鄰體基質蛋白的修飾）。
副甲狀腺癌: 副甲狀腺癌
在治療開始後的71天通過CT掃描觀察到了 副甲狀腺癌 88%的腫瘤縮減。 V16-6與ELBD相比，缺失了YTGIRCSH這段序列，而其穿膜大受影響，說明N端這段序列對保持ELBD高效穿膜協同性的重要性。 也有可能是缺失了這段序列，導致了第二個Cys的缺失，從而影響了這個結構域的空間結構成環。 因爲依據計算機模建的結果，第二個Cys和第三個Cys之間是不太可能形成一個環狀結構的，可能的原因是兩個Cys之間緊靠有一段putatively形成α-螺旋結構的序列，造成兩者間二硫鍵形成的困難。
副甲狀腺癌: 副甲狀腺がんはどんな病気ですか
圖9a_b中顯示了在Ad5-DM-GM_CSF治療之前和之後，患有卵巢癌的患者和患有間皮瘤的患者（見表1)的CT掃描。 使用提取自Ad5/3-DM-Cox2L(lX vp/ml)在正常人血清中的系列稀釋液的 DNA來生成迴歸標準曲線。 對於所述檢測而言，檢測的極限和定量的極限是500vp/ml血清。
副甲狀腺癌: 患者様へ病気と治療
從保藏菌株的固體LB培養基平板上挑取一個轉化有EGFP-TAT-pET28a質粒的單菌落於30ml含有卡那黴素(10-50mg/L)的LB液體培養基中在37℃振盪培養至OD600約爲0.5-1.0。 ①EGFP-ELBD-H2-pET28a質粒構建方案如實施例1中所述。 隨後從保藏菌株的固體LB培養基平板上挑取一個轉化有EGFP-ELBD-H2-pET28a質粒的單菌落於30ml含有卡那黴素(10-50mg/L)的LB液體培養基中在37℃振盪培養至OD600約爲0.5-1.0。 ①EGFP-Tn-HBD-pET28a質粒構建方案如實施例1中所述。 從保藏菌株的固體LB培養基平板上挑取一個轉化有EGFP-Tn-HBD-pET28a質粒的單菌落於30ml含有卡那黴素(10-50mg/L)的LB液體培養基中在37℃振盪培養至OD600約爲0.5-1.0。 副甲狀腺癌 轉化E.coli DH5α菌株，培養，回收重組質粒DNA，測序驗證，即構建完成系列EGFP-Tn-HBD-pET28a表達載體，n＝1-12。
副甲狀腺癌: 副甲狀腺について
可使用任何常規的方法來將所述載體或組合物施用給受試者。 施用途徑取決於組合物的製劑或形式、疾病、腫瘤的位置、患者、合併症和其它因素。 在本發明的優選實施方式中，所述施用是通過腫瘤內、肌內、動脈內、靜脈內、胸膜內、囊內、腔內或腹膜注射進行的， 或者是口服施用。
副甲狀腺癌: 副甲狀腺がん
用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過內切核酸酶限制性消化產生的DNA區段，所述的兩種聚合酶用其3′,5’-核酸外切活性除去突出的γ-單鏈末端，並用其聚合活性補平3’-凹端。 然後在能催化平端DNA分子連接的酶，如噬菌體T4DNA連接酶的存在下將平端區段與大摩爾過量的接頭分子一起保溫。 然後用適當的限制性酶裂解這些DNA區段，並連接至已用酶裂解的表達載體中，所述酶能產生與所述DNA區段相容的末端。
本發明的溶瘤性腺病毒載體誘導病毒粒子介導的對腫瘤細胞的溶瘤作用並活化抗腫瘤細胞的人免疫應答。 在本發明的優選實施方式中，所述方法或用途還包括施用能夠下調受試者中的調節性T細胞的物質。 副甲狀腺癌 “能夠下調調節性T細胞的物質”指減少被鑑別爲T 抑制因子或調節性T細胞的細胞的量的試劑。 這些細胞被鑑別爲含有下列免疫表現型標誌物的一種或多種：CD4+，CD25+，FoxP3+, CD127-和GITR+。 此類減少T抑制因子或調節性T 細胞的試劑可選自：抗CD25抗體或化療劑。 更特別地，本發明涉及溶瘤性腺病毒載體以及包含所述載體的細胞和藥物組合物。
