這些CDR形成環狀結構，透過其間的FR形成的β折疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的CDR和相應輕鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位址。 腫瘤放射治療2025 可以透過比較同類型的抗體的胺基酸序列來確定是哪些胺基酸構成了FR或CDR區域。 腫瘤放射治療 在另一優選例中，所述的其他藥物或治療方法包括：抗腫瘤免疫治療藥物、腫瘤標靶藥物、腫瘤化療藥物、腫瘤放射治療。
然而，在體內標的細胞(癌細胞)的刺激下，CAR-T細胞才會快速增殖、釋放大量的細胞激素，從而透過細胞激素毒殺標的細胞。 因此，細胞激素風暴不可片面的認定爲CAR-T的副作用，也是CAR-T在體內有效的臨牀表現。 腫瘤放射治療2025 目前，在CAR-T臨牀治療中，尚無法避免細胞激素風暴的產生，只能依靠密切觀察、積極應對等常規對症治療手段。 將表2所示的23種抗體加入到FMC63-CAR-T細胞，在不同時間點檢測FMC63-CAR-T細胞的密度和數量。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
向MSD培養盤中加入300 µl封阻液封阻2小時，把配置好的混合PC，一定濃度的biotin-FMC63-scFv與一定濃度的sulfo-tag-FMC63-scFv的混合液吸取100 µl在另一塊培養盤中培育1小時。 把培育的混合液以及每孔50 µl的體積轉移至MSD培養盤中培育1小時。 選取單選殖株細胞mAb02、mAb06、mAb07、mAb020 、mAb023進行DNA定序，定序後得到的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列如表6所示，表6還顯示了抗體定序分析後得到的CDR區。 根據初步的ELISA結果，D value ＞ 10，得到103個選殖株進行二次篩選。 使用ELISA和FACS方法對103個選殖株進行進一步篩選，得到23個單選殖株細胞表現結合FMC63的抗體(對應表2中的mAb01-mAb023)。 將FMC63-scFv-mFc(FMC63抗體的一條鏈)的核苷酸序列併入到真核細胞表現載體中，使用PEI將攜帶FMC63核苷酸的表現載體轉入293細胞中，使其表現FMC63蛋白，使用protein A管柱純化得到FMC63蛋白(FMC63-scFv-mFc蛋白)。
- 每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位。
- 此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。
- 所述的藥物輔料爲本領域常規的藥物輔料，較佳的包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。
典型地，所述抗體偶聯藥物包括所述抗體、以及效應分子，所述抗體與所述效應分子偶聯，並優選爲化學偶聯。 此外，所述效應分子可以是毒蛋白、化療藥物、小分子藥物或放射性核種中的一種或多種。 通常，在適合本發明抗體表現的條件下，培養轉形所得的宿主細胞。 然後用常規的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的抗體。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
所述的抗體全長蛋白爲本領域常規的抗體全長蛋白，其包括重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈恆定區和輕鏈恆定區。 所述的蛋白質的重鏈可變區和輕鏈可變區與人源重鏈恆定區和人源輕鏈恆定區構成全人源抗體全長蛋白。 較佳地，所述的抗體全長蛋白爲IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。 一般，抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱爲可變區域，將該段間隔成4個框架區域，4個FR的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。
- 本發明的第十五方面，提供了一種體外檢測(包括診斷性或非診斷性)樣品中CD19抗體的方法，所述方法包括步驟： 在體外，將所述樣品與本發明第五方面所述的抗體接觸； 檢測是否形成抗原-抗體複合物，其中形成複合物就表示樣品中存在CD19抗體。
- 在另一優選例中，所述的載體包括：細菌質體、噬菌體、酵母質體、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒、或其他載體。
- 細胞激素風暴是指在對人體完成CAR-T輸液後，T淋巴細胞在體內被活化並快速增殖，引起了TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等細胞激素過度的級聯釋放。
- 在本發明的第五方面，提供了一種抗體，所述抗體具有： 本發明第一方面所述的重鏈可變區；和/或 本發明第三方面所述的輕鏈可變區； 或者，所述抗體具有：本發明第二方面所述的重鏈；和/或本發明第四方面所述的輕鏈。
- 脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據其恆定區的胺基酸序列歸爲明顯不同的兩類(稱爲κ和λ)中的一類。
- 每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。
抗體藥已經應用到抗腫瘤領域和自體免疫的治療，同時在抗病毒和細菌感染、心腦血管、糖尿病以及罕見病治療等領域也發揮越來越重要的作用，是當前生物藥中複合增長率最高的一類藥物。 一種體外檢測樣品中CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的細胞的方法，所述方法包括步驟： 在體外，將所述樣品與請求項5所述的抗體接觸； 檢測是否形成抗原-抗體複合物，其中形成複合物就表示樣品中存在CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的細胞。 一種在體內中和CD19抗體或中和在細胞上表現的標靶CD19的CAR的方法，所述方法包括：給需要的對象施用如請求項5所述的抗體、如請求項7所述的抗體藥物偶聯物、如請求項9所述的工程化免疫細胞、或其組合。 一種重組蛋白，其特徵在於，所述的重組蛋白具有： 如請求項1所述的重鏈可變區、如請求項2所述的重鏈、如請求項3所述的輕鏈可變區、如請求項4所述的輕鏈、或如請求項5所述的抗體；以及 任選的協助表現和/或純化的標籤序列。 腫瘤放射治療2025 本發明中，較佳地，所述的藥物組成物的施用量爲有效量，所述有效量爲能夠緩解或延遲疾病、退化性或損傷性病症進展的量。 所述有效量可以以個體基礎來測定，並將部分基於待治療症狀和所尋求結果的考慮。
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所述的抗原抗體結合域蛋白質片段爲本領域常規的抗原抗體結合域蛋白質片段，其包括輕鏈可變區、輕鏈恆定區和重鏈恆定區的Fd段。 較佳地，所述的抗原抗體結合域蛋白質片段爲Fab和F(ab’)。 抗體是生物體在抗原刺激下產生的具有保護作用的蛋白質，由漿細胞分泌到血液等體液中。 抗體可以與抗原特異性結合，起到中和毒素、阻止病原體入侵等作用。 根據抗體與抗原特異結合的特性，可以開發針對疾病特異性生物標的的抗體藥物用於治療疾病。
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在另一優選例中，所述檢測試劑、檢測盤或套組用於ELISA檢測、FACS檢測、電化學發光檢測、酵素連結免疫分析法。 腫瘤放射治療2025 其中在ELISA檢測中mAb06 、mAb023 親和力最優，mAb020 在FACS檢測中親和力最優。 腫瘤放射治療2025 在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代的至少一個胺基酸序列爲同源性爲至少80%的胺基酸序列。 在另一優選例中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量，不超過初始胺基酸序列總胺基酸數量的40%，較佳地爲20%，更佳地爲10%。
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一種抗CD19抗體的抗體及其製備和應用 本發明涉及生物醫藥領域，更具體地涉及一種抗CD19抗體的抗體及其製備和應用。 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作爲參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作爲參考那樣。 此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
不同類免疫球蛋白的次單元結構和三維構型是本領域人員所熟知的。 在本發明的第二十二方面，提供了一種雙特異性抗體，所述的雙特異性抗體包括：本發明第五方面所述抗體和第二抗體，所述的第二抗體選自下組：CD3、CD47、PD-1、PD-L1抗體，以及抗BCMA、CD20、CD22、CD33、CD123抗抗體。 本發明的第十四方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞含有本發明第十三方面所述的載體或基因組中併入有本發明第十二方面所述的多核苷酸。 在另一優選例中，所述檢測試劑、檢測盤或套組用於： 檢測樣品中的CD19抗體；和/或 檢測免疫細胞表面的CD19抗體；和/或 檢測表現CD19抗體的免疫細胞。
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本發明中，所採用的樣本(樣品)包括細胞、組織樣本和活體組織切片標本。 本發明使用的術語“活體組織切片”應包括本領域技術人員已知的所有種類的活體組織切片。 因此本發明中使用的活體組織切片可以包括例如腫瘤的切除樣本、透過內窺鏡方法或器官的穿刺或針刺活體組織切片製備的組織樣本。 抗體上某些殘基(如Cys或Lys等)用於與多種功能基團相連，其中包括成像試劑(例如發色基團和螢光基團)，診斷試劑(例如MRI對比劑和放射性同位素)，穩定劑(例如乙二醇聚合物)和治療劑。 功能劑(例如藥物，檢測試劑，穩定劑)被偶聯(共價連接)至抗體上。 本發明的第十六方面，提供了一種檢測盤，所述的檢測盤包括：基板(支撐盤)和測試條，所述的測試條含有本發明第五方面所述的抗體或本發明第九方面所述的免疫偶聯物。
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根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分爲不同的種類。 主要有5類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成亞型(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。 腫瘤放射治療2025 腫瘤放射治療 對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱爲α、δ、ε、γ、和μ。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
本發明的單株抗體能夠高特異性地結合CD19抗體並阻斷CD19抗體的功能。 如請求項10所述的用途，其特徵在於，所述的藥物用於中和CD19抗體或用於封阻在細胞上表現的標靶CD19的CAR。 一種CAR建構物，其特徵在於，所述的CAR建構物的抗原結合結構域包含如請求項1所述的重鏈可變區和如請求項3所述的輕鏈可變區，較佳地，所述嵌合抗原受體構成還包含：樞紐區、跨膜區、共刺激信號區和CD3z。 一種抗體，其特徵在於，所述抗體具有： 如請求項1所述的重鏈可變區；和/或 如請求項3所述的輕鏈可變區； 或者，所述抗體具有：如請求項2所述的重鏈；和/或如請求項4所述的輕鏈。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
本發明所述抗體也可以是由核苷酸序列在細胞內表現用於細胞治療，比如，所述抗體用於嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)等。 配製好的藥物組成物可以透過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：瘤內、腹膜內、靜脈內、或局部給藥。 腫瘤放射治療 典型地，本發明所述的藥物組成物的給藥途徑較佳地爲注射給藥或口服給藥。 所述注射給藥較佳地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射等途徑。
所述非選擇性偶聯劑是指使效應分子和抗體形成共價鍵連接的化合物，如戊二醛等。 所述利用羧基的偶聯劑可以是順烏頭酸酐類偶聯劑(如順烏頭酸酐)、醯基腙類偶聯劑(偶聯位址爲醯基腙)中的任意一種或幾種。 本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啓動子或者控制序列的載體。 本發明抗體或其片段的DNA分子的序列可以用常規技術，比如利用PCR擴增或基因組庫篩選等方法獲得。
這些嵌合和人源化的單株抗體可以採用本領域熟知的DNA重組技術製備。 本發明的第十八方面，提供了一種重組多肽的製備方法，所述方法包括： 在適合表現的條件下，培養本發明第十四方面所述的宿主細胞； 從培養物中分離出重組多肽，所述的重組多肽是本發明第五方面所述的抗體或本發明第六方面所述的重組蛋白。 本發明的第六方面，提供了一種重組蛋白，所述的重組蛋白具有： 如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或本發明第五方面所述的抗體；以及 任選的協助表現和/或純化的標籤序列。 如本文所用，術語“抗體”或“免疫球蛋白”是有相同結構特徵的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成。 每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。 每條輕鏈的一端有可變區，另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。
本領域技術人員可以透過使用個體基礎等上述因素和使用不超過常規的實驗來確定有效量。 本發明中，較佳地，本發明所述的藥物組成物還包括一種或多種藥用載劑。 所述的藥用載劑爲本領域常規藥用載劑，所述的藥用載劑可以爲任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物輔料。 所述的藥物輔料爲本領域常規的藥物輔料，較佳的包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。 更佳地，所述的藥物組成物包括0.01～99.99%的上述蛋白質和0.01～99.99%的藥用載劑，所述百分比爲佔所述藥物組成物的質量百分比。
利用FMC63設計的CAR-T細胞藥物已經成功上市，在治療B-ALL和NHL上有較好的療效。 應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。 腫瘤放射治療 在另一優選例中，所述的載體包括：細菌質體、噬菌體、酵母質體、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒、或其他載體。 在另一優選例中，所述的CD19高度表現的腫瘤指腫瘤組織中CD19轉錄本和/或蛋白的位準L1與正常組織中轉錄本和/或蛋白的位準L0之比，L1/L0≥2，較佳地≥3。 細胞激素風暴是指在對人體完成CAR-T輸液後，T淋巴細胞在體內被活化並快速增殖，引起了TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等細胞激素過度的級聯釋放。
目前，已經可以完全透過化學合成來得到編碼所述的本發明的抗體(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。 然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。 本發明不僅包括完整的抗體，還包括具有免疫活性的抗體的片段或抗體與其他序列形成的融合蛋白。 本發明的第十七方面，提供了一種套組，所述套組中包括： 第一容器，所述第一容器中含有本發明第五方面所述的抗體；和/或 第二容器，所述第二容器中含有抗本發明第五方面所述的抗體的二抗； 或者，所述套組含有本發明第十六方面所述的檢測盤。 本發明的第十五方面，提供了一種體外檢測(包括診斷性或非診斷性)樣品中CD19抗體的方法，所述方法包括步驟： 在體外，將所述樣品與本發明第五方面所述的抗體接觸； 檢測是否形成抗原-抗體複合物，其中形成複合物就表示樣品中存在CD19抗體。 本發明的第七方面，提供了一種CAR建構物，所述的CAR建構物的抗原結合結構域的scFv段爲特異性結合於CD19抗體的結合區，並且所述scFv具有如本發明第一方面所述的重鏈可變區和如本發明第三方面所述的輕鏈可變區。
在另一優選例中，所述的藥物用於阻斷CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的免疫細胞功能。 本發明的第八方面，提供了一種重組的免疫細胞，所述的免疫細胞表現外源的如本發明第七方面所述的CAR建構物。 在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的衍生序列具有抑制CD19抗體活性的功能。 如請求項11所述的用途，其特徵在於，所述細胞包括表現標靶CD19的CAR的腫瘤細胞或免疫細胞，較佳地爲表現標靶CD19的CAR的腫瘤B細胞和表現標靶CD19的CAR的T細胞。 選用結合FMC63不同表位的抗體組合等濃度混合後作爲陽性品，設計抗抗體檢測實驗。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
本發明的第十九方面，提供了一種清除CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的免疫細胞的方法，所述方法包括：給需要的對象施用本發明第五方面所述的抗體、所述抗體的抗體-藥物偶聯物、或表現所述抗體的CAR-T細胞、或其組合。 其中所述重組表現載體可透過本領域常規方法獲得，即：將本發明所述的核酸分子連接於各種表現載體上建構而成。 所述的表現載體爲本領域常規的各種載體，只要其能夠容載前述核酸分子即可。 所述載體較佳地包括：各種質體、黏接質體、噬菌體或病毒載體等。 所述核酸的製備方法爲本領域常規的製備方法，較佳地，包括以下的步驟：透過基因轉殖技術獲得編碼上述蛋白質的核酸分子，或者透過人工全序列合成的方法得到編碼上述蛋白質的核酸分子。
結果如圖6、7、8顯示，抗FMC63抗體可以促進FMC63-CAR-T細胞的增殖、活化和細胞激素釋放。 結果如圖4和表7所示，MSD檢測結果顯示抗FMC63抗體可以與FMC63-scFv按照劑量依賴的方式結合，說明抗FMC63抗體可以應用到MSD方法中。 FACS檢測方法如下：將mAb與Jurkat-FMC63 scFv細胞混合，室溫培育30分鐘後DPBS洗一次，加抗鼠Fc抗體室溫培育30分鐘，DPBS洗一次後流式細胞儀上機檢測。 透過ELISA/FACS篩選免疫有反應的小鼠，取小鼠脾臟淋巴細胞與Sp2/0-Ag14細胞融合獲得雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞平盤培養至96孔培養盤中進行生長，10-14天後取上清用ELISA/FACS篩選細胞、解離速率常數，選擇高特異的亞選殖株進行擴大培養以及凍存。 在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸序列所形成的序列優選爲同源性或序列相同性爲至少80%，較佳地至少85%，更佳地至少爲90%，最佳地至少95%的胺基酸序列。
如本文所用，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。 它集中於輕鏈和重鏈可變區中稱爲互補決定區或超變區中的三個片段中。 天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結構。 每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位。 恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。 所述單株抗體可以由多種途徑和技術進行研製，包括雜交瘤技術、噬菌體展示技術、單淋巴細胞基因轉殖技術等，主流是透過雜交瘤技術從野生型或基因轉殖小鼠製備單株抗體。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
在本發明的第五方面，提供了一種抗體，所述抗體具有： 本發明第一方面所述的重鏈可變區；和/或 本發明第三方面所述的輕鏈可變區； 或者，所述抗體具有：本發明第二方面所述的重鏈；和/或本發明第四方面所述的輕鏈。 CD19是簇分化抗原的一種，是B細胞增殖、分化、活化及抗體產生有關的重要膜抗原。 絕大多數的B細胞性惡性腫瘤表面都高度表現CD19，多個中心獨立開展的利用嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)修飾的T細胞標靶表現CD19的B細胞復發、難治性惡性腫瘤取得了前所未有的成功。 以CAR-T爲首的免疫療法給無數患者帶來了“治癒癌症”的希望，但CAR-T在具有突出有效性的同時，也有著一個亟待解決的問題，那就是嚴重的副作用——細胞激素風暴。 本發明的藥物組成物可直接用於結合CD19抗體或標靶CD19的CAR-T細胞，因而可用於輔助治療腫瘤等疾病。
